بیان پروتئین انسولین گیاهی در مخمر پروبیوتیک Saccharomyces boulardii

نوع مقاله : مقاله کامل علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه فردوسی مشهد

2 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

3 دانشگاه علوم پزشکی گلستان

چکیده

سابقه و هدف:
دیابت نوعی اختلال مزمن در متابولیسم کربوهیدرات، چربی و پروتئین هاست و مشخصه آن افزایش قند خون در بیمار است. نارسایی قلبی - عروقی، کلیوی و کاهش فعالیت عصبی از جمله عوارض طولانی مدت این بیماری می باشد. کاربرد داروهای گیاهی برای درمان دیابت، روز به روز بیشتر میشود و این مسئله سبب شده شناخت داروی گیاهی کارآمد اهمیت بیشتری یپیدا کند. داروهای گیاهی به دلیل عوارض کمتر، قیمت مناسب و دردسترس بودن نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرارگرفته است. یکی از گیاهان موثر، خربزه تلخ یا کارلا با نام علمی Momordica charantia یک گیاه دارویی متعلق به خانواده کدوئیان (Cucurbitacea) است که به دلیل دارا بودن ترکیباتی از جمله پلی پپتیدی به نام پلی پپتید P یا P- انسولین در درمان دیابت موثر می باشد. P– انسولین متشکل از 172 اسید آمینه است و مقدارش در گیاه بسیار کم است. کلون کردن ژن p- انسولین و بیان بالای آن در میکروارگانیسم، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. استفاده از مخمر پروبیوتیک این مزیت را دارد که پس از تولید پروتئین هدف نیاز به خالص سازی آن نیست در صورتیکه تولید پروتئین نوترکیب در سایر میزبان های بیانی مستلزم خالص سازی آن جهت مصرف می باشد. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p- انسولین پس از بهینه سازی از لحاظ توالی در میزبان مخمر پروبیوتیکی Saccharomyces boulardii بیان شد.
مواد و روش ها:
در این تحقیق بهینه سازی توالی ژن p- انسولین جهت بیان در مخمر پروبیوتیک S. boulardii به دو طریق بهینه سازی کدونی و بهینه سازی ساختار ثانویه mRNA انجام گردید. توالی ژن بهینه سازی شده در وکتور بیانی pESC تحت پروموتر القایی Gal10 کلون و به سلول مستعد S. boulardii ترانسفورم شد. از مخمر نوترکیب استخراج DNA و در ادامه با آغازگرهای اختصاصی ژن p- انسولین واکنش PCR انجام گرفت. مخمر نوترکیب توسط گالاکتوز القاء و تولید پروتئین P– انسولین در سیتوپلاسم مخمر نوترکیب از طریق SDS-PAGE و طیف سنجی جرمی تائید گردید.
یافته ها:
واکنش زنجیره ای پلی مراز با آغازگرهای اختصاصی ژن p- انسولین قطعه 350 جفت بازی را از وکتور بیانی نوترکیب تکثیر کرد که نشان از کلونینگ موفق ژن مذکور بود. الگوی الکتروفورز SDS-PAGE برای S. boulardii میزبان و S. boulardii ترانسفورم شده با ناقل pESC/p-insulin مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج الکتروفورز پروتئین نشان داد که باند پروتئین P– انسولین با وزن مولکولی 18.5 KD و بصورت افتراقی فقط در مخمر نوترکیب بیان گردید. همچنین نتایج طیف سنجی جرمی تایید کرد که باند افتراقی مربوط به پروتئین P– انسولین می باشد.
نتیجه گیری:
در این تحقیق برای اولین بار از مخمر پروبیوتیک S. boulardii به عنوان میزبان موفق برای تولید پروتئین p– انسولین استفاده گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که از مخمر پروبیوتیک S. boulardii می توان به عنوان میزبان مناسب برای تولید سایر محصولات در صنایع غذایی و دارویی استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Expression of plant insulin in probiotic yeast Saccharomyces boulardii

نویسندگان [English]

  • Maryam Rahimi 1
  • Majid Azizi 1
  • Ahad Yamchi 2
  • Majid Shahbazi 3
1 Ferdowsi University of Mashad
2 Gorgan university of agricultural science and natural resources
3 Golestan university of Medical Science
چکیده [English]

Abstract:
Background and objectives:
Diabetes mellitus is a chronic disorder in carbohydrate, fat and protein metabolism. Its characteristic is an increase in blood sugar in the patient. The long-term complications of this disease is cardiovascular, renal failure and neurological activity. The use of herbal medicines for the treatment of diabetes is increasing day by day and this has made it more important to recognize the effective herbal medicine. Herbal remedies have been taken into consideration because of fewer complications, reasonable prices, and availability of chemical drugs. The Momordica charantia (Linn Family: Cucurbaceae), whose fruit is known as Karela or bittergourd, is an important anti-diabetic plant. One of the anti-diabetic agents of Karela is Polypeptid-P (p- insulin), a 172 amino acid. The content of polypeptide-P in cultivated plants is relatively low so gene cloning and expression of this polypeptide in microorganism is a quick and useful alternative for solving such problem. The probiotic host has the advantage that after the production of target protein, it is not necessary to purify it but producing recombinant protein in other expression hosts need to be purified. Therefore, in this study p- insulin gene was optimized and expressed in probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Material and method:
In this research, the sequence of p- insulin gene was optimized for both codon bias and secondary structure of mRNA to effectively express in the probiotic yeast Saccharomyces boulardii. The optimized gene was cloned into the pESC expression vector under Gal10 promoter and transformed to competent cell. Recombinant yeast was extracted DNA then the PCR reaction was done by p- insulin specific primers. Recombinant yeast was induced by galactose and production of P-insulin protein in the recombinant yeast cytoplasm was verified by SDS-PAGE and mass spectrometry.
Results:
A 350 base pair production was amplified by p-insulin specific primers in the polymerase chain reaction. SDS-PAGE electrophoresis pattern was compared host S. boulardii and transformed S. boulardii carrying pESC/p-insulin construct. Electrophoresis results showed that the 18.5 KD molecular weight p- insulin protein differential band was expressed just in the recombinant yeast and also mass spectrometry results confirmed differential band as a p- insulin protein.
Conclusion:
In this study, probiotic yeast Saccharomyces boulardii was used as a successful host to producing p- insulin protein for the first time. This research showed that probiotic yeast S. boulardii can used as a suitable host cell to producing other products in the food and pharmaceutical industries.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Momordica charantia
  • P- insulin protein
  • Saccharomyces boulardii
  • SDS-PAGE
  • Mass spectrometry

مراجع

  1. Babendure J.R., Babendure J.L.Ding J.H., and Tsien R.Y. 2006. Control of mammalian translation by mRNA structure near caps.RNA 12: 851-861.
  2. Bagherpour, G., Ghasemi, H., Zand, B., Zarei, N., Roohvand, F., Ardakani, EM., Azizi, M., and Khalaj, V. 2018. Oral Administration of Recombinant Saccharomyces boulardii Expressing Ovalbumin. CPE Fusion Protein Induces Antibody Response in Mice.Front Microbiol.9:723.
  3. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.72: 248-254.
  4. Burns, AJ., and Rowland, IR. 2000. Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr Issues Intest Microbiol. 1: 13-24.
  5. Da Silva, NA., Srikrishnan, S. 2012. Introduction and expression of genes for metabolic engineering applications in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 12: 197-214.
  6. Demain, AL., and Vaishnav, P. 2009 .Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 27: 297-306.
  7. Drocourt, D., Calmels, T., Reynes, J.P., Baron, M., Tiraby, G. 1990. Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Res.18:4009.
  8. Gasser, B., Saloheimo, M., Rinas, U., Dragosits, M., Rodriguez-Carmona, E., Baumann, K., Giuliani, M., Parrilli, E., Branduardi, P., Lang, C., Porro, D., Ferrer, P., Tutino, ML., Mattanovich, D., and Villaverde, A.2008. Protein folding and conformational stress in microbialcells producing recombinant protein: a host comparative overview. Microb Cell Fact.7:11.
  9. Hennequin, C., Thierry, A., Richard, G.F., Lecointre, G. Nguyen, H.V., C., Gaillardin, and Dujon, B. 2001. Microsatellite typing as a new tool for identification of  Saccharomyces cerevisiae strains. J. Clin. Microbiol. 39: 551-559.
  10. Hoffmann C.S., and Winston, F. 1987. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene, 57: 267-272.
  11. Kole, C. and Chen, F. 2012. Genomic resources for discovery of genescontrolling biosynthesis of charantin and polypeptide-P, and molecular breeding in bitter melon. REEIS.
  12. Kochetov, A., Palyanov, A., Titov, I., Grigorovich, D., Sarai, A., and Kolchanov, N. 2007. AUG_hairpin: prediction of a downstream secondary structure influencing the recognition of a translation start site. BMC Bioinformatics, 8: 318.
  13. Kozak M. 1990. Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes. Proc Nat. Acad. Sci. USA, 87: 8301-8305.
  14. Kudla, G., Murray, A.W., Tollervey, D., and Plotkin J.B. 2009. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science, 324: 255-258.
  15. Mallie, M., van Nguyen, P., Bertout, S., Vaillant, C. and Bastide, J. 2001. Genotypic study of Saccharomyces boulardii compared to the Saccharomyces sensu stricto complex species. J. Mycol. Med. 11:19-25.
  16. Pakbaten, B., Heravi, R.M., Kermanshahi, H., Sekhavati, M.H., Javadmanesh, A., and Ziarat, M.M. 2018. Production of phytase enzyme by a bioengineered probiotic for degrading of phytate phosphorus in the digestive tract of poultry. Probiotics and antimicrobial proteins, 1-8.
  17. Paul, A., and Raychaudhuri, S. 2010. Medicinal Uses and Molecular Identification of Two Momordica charantia Varieties – a review, Electronic, Journal of Biology,6: 43-51.
  18. Rahman A and Zaman, K. 1989. Medicinal plants with hypoglycemic activity. J, Ethnopharmacol. 26:1-55.
  19. Sarate, P.J., Heinl, S., Poiret, S., Drinić, M., Zwicker, C., Schabussova, I., Daniel, C., and Wiedermann, U. 2019. E. coli Nissle 1917 is a safe mucosal delivery vector for a birch-grass pollen chimera to prevent allergic poly-sensitization. Mucosal Immun.12: 132-144.
  20. Tolman, K.G., and Chandramouli, J. 2003. Hepatotoxicity of the thiazolidinediones. Clin Liver Dis. 7: 369-379.
  21. Tuller, T., Waldmanc, Y.Y., Kupiecd, M., and Ruppinc, E. 2010. Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107: 3645–3650.
  22. Tuller T., and Zur, H. 2015. Multiple roles of the coding sequence 5 end in gene expression regulation. Nucleic Acids Research, 43:13-28.
  23. Venkatesh, S., Reddy, GD., Reddy, BM., Ramesh, M., and Rao, A.V. 2003. Antihyperglycemic activity of Caralluma attenuata.Fitoterapia 74:274-279.
  24. Zylicz-Stachula A., Zolnierkiewicz O., Sliwinska K., Jezewska-Frackowiak J., and Skowron P.M. 2014. Modified ‘one amino acid-one codon’ engineering of high GC content TaqII-coding gene from thermophilic Thermus aquaticus results in radical expression increase. Microbial Cell Factories 13:7.
نشریه فرآوری و نگهداری مواد غذایی
دوره 12، شماره 1
مرداد 1399
صفحه 1-16

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار